-
Confocale microscoop verwijst naar een soort speciale optische microscoop die optische plakjes kan opnemen.
Door een enkel diffractielimietpunt te verlichten en te observeren, wordt optische snijblokken gerealiseerd in een laserconfocaal systeem. Dit vereist dat de twee bundelsegmenten dezelfde focus hebben, dus ze zijn "confocaal". In tegenstelling tot afbeeldingen met een brede veld, hebben confocale afbeeldingen geen onschadelijke vervaging. Dit is een voordeel op zich, omdat het diepe beeld van het monster duidelijk en rijk is aan details. Het belangrijkste voordeel is echter het driedimensionale visualisatiepotentieel met microscopische kenmerken. Nadat de beeldreeks langs de Z-stapel is verkregen, wordt het 3D-object gereconstrueerd en weergegeven door de computer.
- Confocale verlichting
Point Light Source Illumination wordt gerealiseerd door de lichtbron op een klein diafragma (pinhole) te concentreren en deze vervolgens op het monster te concentreren. Wanneer de opening klein genoeg is, wordt het verlichtingspunt alleen beperkt door diffractie, niet door de geometrische parameters van lichtbron en diafragma. De gewone lichtbron is een grote oppervlaktelichtbron, dus het is onmogelijk om het te concentreren op de diffractielimietplek. Hoewel de transmissie erg laag is, is dit soort gerichte verlichtingslicht daarom nog steeds zeer noodzakelijk (voor traditionele lichtbronnen).
Figuur 1: Verlichting voor confocale beeldvorming. Het licht van de lichtbron (LS) is gefocust op de verlichting pinhole (PI) en komt vervolgens in het monster S ..
Laser als lichtbron heeft een zeer hoge collimatie (het licht in een goede laser is "extreem parallel"). Daarom kan de laser worden gericht op een diffractie-beperkte plek door een enkele lens zonder een pinhole te gebruiken. Daarom hebben de meeste confocale microscopen geen verlichting pinhole. De kwaliteit van de lichtvlek hangt af van de straalkwaliteit van de laser. Als de kwaliteit niet goed is, kunt u ook het verlichtings -pinhole plaatsen. De laser wordt meestal gekoppeld aan de confocale microscoop door optische vezels. Deze vezels zelf fungeren ook als pinholes.
De focalisatie en hoge energiedichtheid van laser maken het een ideale lichtbron voor confocale microscoop. Coherentie van laser is geen vereiste kenmerk van confocale prestaties. Integendeel, het is een uitdaging voor optische ontwerpers, omdat het valse interferentiepatronen zal veroorzaken, dus zorgvuldige ontwerpstrategieën zijn nodig.
Bovendien heeft het feit dat de traditionele laser slechts een enkele kleur (laser-"lijn") zijn eigen beperkingen heeft. Bij multi-fluorescentiebeeldvorming en -meting is complexe multi-laser-opstelling nodig. Witte laser lost vakkundig het probleem op van veelkleurige beeldvorming.
Figuur 2: Vergelijking van confocale (rechter gebied) en niet-confocale beeldvorming. In Feulgen gekleurde muis trofoblast. Veel informatie over niet-confocale afbeeldingen komt niet uit het brandvlak. Confocale optiek elimineert alle fuzzy -factoren en maakt de structuur duidelijk.
Confocale detectie
De meeste detectoren hebben een vrij groot gevoelig gebied (fotomultiplicator buizen zijn meestal verschillende vierkante centimeters). Confocale optiek heeft puntdetectie nodig. Daarom is het noodzakelijk om spotdetectie uit te voeren door een klein diafragma (pinhole) in de lichtstraal in te voegen. Het licht van het monster op het pinhole concentreren, het verzamelen en opnemen van het uitgezonden licht.
Omdat het diffractiepatroon afhankelijk is van de numerieke opening en golflengte, is de detectie van pinhole noodzakelijk. Daarom moet de pinhole -grootte worden aangepast wanneer deze parameters veranderen.
Wanneer de objectieve lens verandert (meestal met de verandering van numerieke opening), zal de moderne confocale scanningmicroscoop de diameter van de pinhole op de juiste manier automatisch wijzigen. Daarom zijn pinholes meestal ontworpen als dubbele of meerlagige openingen.
In feite hangt de juiste grootte van pinhole niet alleen af van golflengte en numerieke opening, maar ook van de interne vergroting van optische elementen in microscoop.
Daarom is het niet alleen ongewenst, maar ook verkeerd om pinhole diameters in microscopen direct te vergelijken met verschillende ontwerpen. Als de pinhole -diameter niet is ingesteld op de optimale waarde, kan het systeem niet soepel optisch snijden (dat wil zeggen, defocus vervaging verzenden), of de intensiteit onnodig afsnijden zonder verdere optische snijwaliteit te verkrijgen (resulterend in onnodige ruisbeelden).
Figuur 3: Detectie in confocale beeldvorming. Het licht van het monster S is gericht op de observatie Pinhole (PO) en vervolgens op de detector DE.
Optisch pad van confocaal scannen
Het confocale straalpad in confocaal scansysteem is slechts de combinatie van puntbronverlichting en puntdetectie. Deze combinatie kan worden gebruikt als een optisch mes. Alleen fotonen van het brandvlak kunnen naar de sensor worden overgedragen. Terwijl alle fotonen van andere plaatsen worden uitgefilterd. Optisch snijden wordt gerealiseerd door middel van "ruimtelijk filter".
Omdat slechts één plek in een bepaalde tijd "confocale" beeldvorming lijkt, is een scanapparaat nodig om de plek op het objectveld in een rastermodus te verplaatsen. Gewoonlijk wordt de optische spiegel op de scanmotor geïnstalleerd en gebruikt om de scanprocedure uit te voeren. Er is een knelpunt in de tijd die nodig is om een volledig frame (meestal) 1.024 lijnen te scannen. Verbeteringen zijn bereikt door een hogesnelheidsscanner (resonantiescanner) te introduceren die 8, 000 of meer regels per seconde scant.
Alleen onder de microscooptechnologie van gereflecteerd licht kan een goede optische plak worden bereikt. Dit is een van de redenen voor de krachtige ontwikkeling van fluorescentiemicroscopie in de afgelopen 20 jaar (andere redenen omvatten de uitvinding van immunokleuring, DNA-hybridisatie, fluorescerende biosensor, kwantumstippen en fluorescerend eiwit).
Figuur 4: Van links naar rechts: 1. De verlichtingskegel boeit niet alleen de fluorescerende kleurstof in het brandvlak, maar boeit het ook op en neer. Hier vertegenwoordigd door een groene dubbele kegel. 2. De emissie -pinhole onderschept effectief het licht dat wordt uitgestoten van boven het brandvlak. 3. Bovendien zal het licht van onder het brandvlak niet door het pinhole gaan. 4. In het confocale systeem zal alleen het licht van het monster de detector bereiken. Het detecteren van pinholes zal elk licht van andere gebieden effectief afwijzen. Ten slotte wordt de echte optische sectie verkregen.
